沙门氏菌是引起食物中毒的主要病原菌之一。用于食品中沙门氏菌检测的标准培养方法耗时长，阴性结果的确认需要五天的时间（2）。酶免疫分析筛选技术可使该实验简化并缩短时间。VIDAS沙门氏菌试剂盒（SLM）是检测食品和环境样品中沙门氏菌的全自动酶免疫分析技术。沙门氏菌抗原复杂，通过对菌体（O）脂多糖和鞭毛（H）蛋白抗原的鉴别可区分为2200个血清型。VIDAS SLM技术应用针对O和H抗原的高特异性单克隆抗体，能够检测有动力或无动力的沙门氏菌。四十五分钟内完成测定。

　　固相容器（SPR）是类似于加样头的一次性装置，用作固相及加样器之用。SPR用抗沙门氏菌抗体包被。实验所需试剂均封闭在试剂条内。

　　VIDAS系统自动完成全部实验程序。将煮沸过的增菌肉汤加于试剂条上，样品将在SPR内定时循环，样品中的沙门氏菌抗原与包被在SPR内壁的沙门氏菌单克隆抗体结合，未结合的样本则被洗去。抗体-碱性磷酸酶复合物在SPR内外循环并与SPR内壁捕获的沙门氏菌抗原结合，最后洗去未结合复合物。

　　SPR中加入荧光底物，4-甲基-香豆素-磷酸酯，SPR壁上存留的酶将催化底物分解为荧光产物4-甲基-伞形酮。VIDAS的光扫描仪在450nm处自动测定荧光强度。

　　SRP在生产时以抗沙门氏菌单克隆抗体包被。每一SPR上均标有“SLM”。从包装袋中取出SPR后要及时封闭包装袋。

试剂条

沙门氏菌试剂条说明

　　*刺激性试剂

　　－R36：对眼睛有刺激

　　－最小加样量为0.5ml的加样器。

　　－水浴箱（95-100℃）或相当装置。

　　－缓冲蛋白胨水225ml(biomérieux 货号42043)。

　　－其它适合的非选择性前增菌培养基。

　　－Rappaport Vassiliadis肉汤(biomérieux 货号42073)。

　　－亚硒酸盐胱氨酸肉汤(biomérieux 货号42052)。

　　－M肉汤(biomérieux 货号42077，20管)。

　　－四硫磺酸盐肉汤。

　　－选择性琼脂平板：

　　如：

　　　－Hekion 琼脂(biomérieux 货号43111)。

　　　－SMID琼脂(biomérieux 货号43291)。

　　　－XLD琼脂(biomérieux 货号43563)。

　　　－硫酸铋琼脂。

　　１.请将VIDAS系统放置在微生物测试专用房间。

　　２.请勿使用超出有效期的试剂。

　　３.不同批号试剂请勿混合。

　　４.使用前，试剂应放至室温（最少30分钟）。

　　５.试剂中含1g/l叠氮钠，该物质可与铅或铜管道反应形成爆炸性金属叠氮物。如果含叠氮钠的液体在这样的管道系统中处理，要用大量的水冲洗以避免形成金属叠氮物。

　　６.加有底物的比色杯含有刺激性试剂（乙醇氨），参照以上的标记“R”和“S”。

　　７.试剂盒的所有试剂均为潜在生物危险材料。因此，通过可接受的方法来处理所有使用过的试剂和其它污染材料。

　　８.常规清洁和清洗VIDAS仪器，参阅VIDAS操作手册有关步骤。

　　- VIDAS LMO2试剂盒存于2-8℃。

　　- 切勿冷冻试剂。

　　- 打开试剂盒后，SPR包装袋应密封完好，无破损，否则请不要使用SPR.。

　　- 为保持SPR稳定性，从包装袋取出SPR后应小心封好，并放入干燥剂，放回2-8℃贮存。

　　- 如果保存得好，所有试剂在有效期内稳定性不变。

　　对于人和动物食品样本，在进行VIDAS沙门氏菌测定前，bioMérieux推荐使用AFNOR，DIN或BAM/AOAC确认的增菌办　

　　AFNOR (Bio-12/1-04/94) 和 DIN (Ref.Nr.10121:2000-08) 确认的方法

　　１.前增菌：向225ml缓冲蛋白胨水中，用无菌方法加入25g(25ml)标本，或1份标本加入9份稀释剂。消化或混匀，35-37℃孵育16-20小时。

　　２.增菌：孵育后，取1ml悬液加入10ml (1：10稀释) 亚硒酸盐-胱氨酸肉汤中。 35-37℃孵育6-8小时。同时取0.1ml前增菌液加入10ml Rappaport Vassiliadis 肉汤。42℃孵育6-8小时。

　　３.后增菌：孵育后，从亚硒酸盐-胱氨酸肉汤取1ml加入10ml M肉汤。从Rappaport Vassiliadis 肉汤中取1ml加入另外10ml M肉汤。再孵育亚硒酸盐-胱氨酸肉汤和Rappaport Vassiliadis肉汤18小时。孵育两份M肉汤41-42℃ 16-20小时。

　　孵育之后，从两份M肉汤中各取1ml加入一个试管并在95-100℃水浴中加热15+1分钟。冷却后进行VIDAS测定。将剩余的M肉汤、亚硒酸盐-胱氨酸肉汤和Rappaport Vassiliadis肉汤的标本保存于2-8℃以便对VIDAS沙门氏菌测定阳性结果复查。

　　注：如果不能马上进行VIDAS检测，孵育的肉汤可在2-8℃保存48小时。如需保存更长时间，可在加热前将其冷冻保存

　　４.阳性结果的确证：将保存于2-8℃的增菌肉汤（亚硒酸盐-胱氨酸肉汤和Rappaport Vassiliadis肉汤）和M肉汤转种至专用的琼脂平板（最好用SMID，HEKTOEN或实验室确认的培养基）进行分离培养。

　　１.前增菌：将标本用无菌方法加入非选择性培养基，如BAM中所述。消化或混匀并在35℃孵育24+2小时。

　　２.增菌：孵育后，取1ml前增菌悬液加入10ml四硫磺酸盐肉汤中，42℃孵育6小时(生肉制品孵育18+2小时)。

　　　同时取0.1ml前增菌液加入10ml亚硒酸盐-胱氨酸肉汤。35℃孵育6小时(生肉制品孵育18+2小时)。

　　孵育之后，从两份M肉汤中各取1ml肉汤加入一个试管，100℃水浴15分钟，冷却后进行VIDAS测定。其余的M肉汤、亚硒酸盐-胱氨酸肉汤和Rappaport Vassiliadis肉汤4℃储存，以备对阳性标本的复查。

　　注：如果不能马上进行VIDAS检测，孵育的肉汤可在2-8℃保存48小时。如需保存更长时间，可在加热前将其冷冻保存

　　由于生产方式多样，生物梅里埃建议采用以下方法：

　　１.前增菌：将样本1：10稀释于缓冲蛋白胨水中。物体表面的采样样本可能含有残留的消毒剂，建议在采样垫、棉球或棉签和前增菌肉汤中加入10%的中和剂（卵磷脂-聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯，组氨酸-硫代硫酸钠）。在37+1℃孵育16-20小时。

　　２.增菌：孵育后，取1ml悬液加入10ml (1：10稀释) 亚硒酸盐-胱氨酸肉汤中。 35-37℃孵育18-24小时。同时取0.1ml前增菌液加入10ml Rappaport Vassiliadis 肉汤，41+1℃孵育18-24小时。

　　３.后增菌：孵育后，从亚硒酸盐-胱氨酸肉汤取1ml加入10ml M肉汤。从Rappaport Vassiliadis 肉汤中取1ml加入另外10ml M肉汤。在所需的温度再孵育亚硒酸盐-胱氨酸肉汤和Rappaport Vassiliadis肉汤。在41+1℃孵育两份M肉汤最少6小时。

　　孵育之后，从两份M肉汤中各取1ml加入一个试管并在95-100℃水浴中加热15+1分钟。冷却后进行VIDAS测定。将剩余的M肉汤、亚硒酸盐-胱氨酸肉汤和Rappaport Vassiliadis肉汤的标本保存于2-8℃以便对VIDAS沙门氏菌测定阳性结果复查。

　　4．阳性结果的确证：操作同AFNOR方法（见上）。

　　１.前增菌：将样本1：10稀释于缓冲蛋白胨水中。样本与前增菌肉汤的体积取决于样本种类，参见COFRAC的详细说明。物体表面的采样样本可能含有残留的消毒剂，建议在采样垫、棉球或棉签和前增菌肉汤中加入10%的中和剂（卵磷脂-聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯，组氨酸-硫代硫酸钠）。在37+1℃孵育16-20小时（粪便样本4小时即可）。

　　２. 增菌：孵育后，取1ml悬液加入10mlMuller-Kauffman肉汤中(或1：10稀释)。 41+1℃孵育18-24小时。

　　３.后增菌：孵育后，从Muller-Kauffman肉汤取0.1ml加入10ml M肉汤（必须在41+1℃预热）。在41+1℃孵育M肉汤最少6小时，最长可延长至24小时。

　　孵育之后，从M肉汤中取1ml加入一个试管并在95-100℃水浴中加热15+1分钟。冷却后进行VIDAS测定。将剩余的M肉汤保存于2-8℃以便对VIDAS沙门氏菌测定阳性结果复查。

　　注：如果不能马上进行VIDAS检测，孵育的肉汤可在2-8℃保存24-48小时。如需保存更长时间，可在加热前将其冷冻保存。

　　４.阳性结果的确证：使用未加热的M肉汤进行VIDAS ICS免疫浓缩（biomérieux 货号30435），然后接种至SMID琼脂（见VIDAS ICS试剂盒说明）。37+1℃孵育24小时后筛选特征性菌落。

　　注意：如对所推荐方法进行任何改动，在使用前必须经过确证。

　　每一个新试剂盒在使用之前，首先要使用试剂盒中的MLE卡向仪器（VIDAS 或mini-VIDAS）输入试剂规格（或出厂的校正曲线数据），否则方法将无法运行。每一盒试剂只需输入一次。

　　可以使用MLE卡自动输入或手动输入。详见VIDAS 或mini-VIDAS操作手册。

　　每一个新试剂盒在输入MLE卡信息之后，需使用试剂盒内的校正液进行校正，以后每14天进行一次校正。此项操作可以提供仪器特定的校正曲线，对于在保存期限内可能出现的小的分析信号偏移可以进行补偿。

　　校正液S1在同一次测试中必须做双份（详见VIDAS操作手册）。校正值必须在设定的RFV(相对荧光值)值之内，否则，需重新校正。

　　１.冰箱中取出VIDAS沙门氏菌盒并置于室温（最少30分钟），其余试剂仍在2-8℃储存。

　　２.在SLM试剂条的空白处，标上样本号。

　　３.输入所需的信息以便建立work list.键入“SLM”至检测编号，再输入将要检测的实验号。如果同时测定标准，则键入“S1”。

　　　注：对于mini-VIDAS，测定标准时，先键入“S”再键入“1”以对其编号。详见VIDAS操作手册。

　　４.使用前将标准、对照和样本旋转混匀。准确吸取0.5毫升标准液，对照液或样本加入SLM试剂条样品孔中央。

　　　注意：在进行VIDAS SLM试验前，增菌肉汤必须在水浴中加热15分钟。

　　５.依屏幕所示，将SPR和试剂条放入VIDAS相应的位置。核对位置以确保SPR上3个字母编码的颜色标记与试剂条相符

　　６.根据VIDAS操作手册开始分析步骤。45分钟内可完成实验。

　　　注：此检测方法与LIS和ECO相同，这三种测试可在同一个反应仓内同时进行。

　　７.所有用过的SPR和试剂条丢弃与适当的容器，并按正确的方法处理潜在的生物危险性材料。

　　试剂盒附有阳性和阴性对照。

　　每批新的试剂盒均应使用阴性和阳性对照进行检测，以证明运输和贮存过程未影响其性能。每次校正时必须测定对照。对阳性和阴性对照分别标以C1和C2，仪器会自动识别。提供的对照品可直接使用，但用前需充分混合再加入试剂条的样品孔。

　　阳性对照数值应在瓶签所示范围之内。如所测数值超过此范围，样本结果不能报告。

　　注：如果标准品数值超过范围，检测值可根据另一个标准重新计算。详见VIDAS操作手册。

　　检测完成后，结果由计算机自动分析。每份样品有两个荧光读数，第一个数值表示SPR未加入底物时，容器和底物的本底。第二个读数表示SPR内面的酶复合物与底物反应后的结果，该数值减去本底后则为相对荧光值（RFV）。计算过程列于结果报告中。

　　每一样本的RFV值由VIDAS按以下公式计算：

检测值=样品RFV/标准RFV

　　打印报告内容包括试验类型、样本号、日期和时间、试剂盒批号及有效期、每个样品的RFV、检测值和相应结果。

　　检测值低于下限提示样品不能检出含有沙门氏菌抗原，若大于或等于上限则为阳性结果。阳性结果必须通过增菌和后增菌来证实。

　　本底数值超过预期的分界值（提示有少量底物污染）时，结果不能采用，可用原标本重复试验。

注意事项

　　VIDAS SLM测试已经通过了大量食品的检测评估。由于食品种类繁多，制作过程多样，生物-梅里埃建议检查所要测试的食品成份以确认保其不影响SLM测试结果的可靠性。

　　VIDAS沙门氏菌试剂盒可监测有动力和无动力的沙门氏菌。测试了含有O和H抗原的300多株菌且检测全部阳性。枸橼酸杆菌和哈夫尼亚菌的某些株可出现交叉反应。

　　以下是在进行AFNOR确证的预实验中得到的结果：

• 特异度：所有50株沙门氏菌均被检出，30株非沙门氏菌未见交叉反应。
• 灵敏度：介于2.2×104和7.7×105细胞/ml。
• 准确度：以下所示是290份样本的测定结果（其中104份是自然染菌）：
• VIDAS SLM的假阴性：4份
• 参比方法的假阴性：3份
• 一致的结果：283份

　　作为沙门氏菌标准化测试的组成部分，由DIN（德国标准化研究所）所进行的预实验使用了肉制品（104份）和脱水牛奶（100份）作为样本，与LMBG 35节做比较，结果如下：

　　-肉制品：　灵敏度：100%　　　特异度：99%

　　-脱水牛奶：灵敏度：101.5%　　特异度：100%

　　对533份储存畜牧原料的环境样本进行外部评估，与COFRAC推荐的方法进行比较，结果如下：

　　1994年4月6日，法国标准化协会（AFNOR）确认了VIDAS 沙门氏菌测试可作为所有人和动物食品的沙门氏菌快速测试方法。方法的确认是通过与NF EN ISO6579标准相比较。BIO-12/1-04/94证书可从我们的试剂部获得，有效期至2002年7月9日。

　　食品中沙门氏菌的VIDAS SLM测试在1996年5月第一次被AOAC采用，AOAC OMA法 N°996.08。

　　VIDAS SLM测试通过了丹麦兽医与食品管理局和加拿大公共卫生部的批准。

　　VIDAS SLM测试在英国成功地通过了欧洲微生物方法评估方案的评估（1998年10月）。

　　食品中沙门氏菌的VIDAS SLM测试在2000年8月由DIN（德国标准化研究所）完成了方法的标准化（Nr.10121:2000-08）。

　　 文中所列资料，均为按本文所示方法操作所得，对该方法作任何改变或修改均可影响结果。如果改变或修改，bioMérieux 将不承担所有保证、许诺或意向，包括对商品的性能和正确操作的保证，以及对仪器间接或重大损坏负任何责任。

　　1.CURIALE et al, Journal of AOAC, 1997, 80, 469-504. 2.

　　2.KERR S., H.J. BALL, D.P. MACKIE, D.A. POLLOCK and D.A. FINLAY, Diagnostic application of monoclonal antibodies to outer membrane protein for rapid detection of Salmonella, Journal of Applied Bacteriology, 1992, 72, 302-308.

　　3. LE MINOR, L., Salmonella liginieres in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 1984, 427-458, Vol. 1. N.R. Kriegand J.G. Holt (eds.),Williams and Wilkins, Baltimore, MD.

　　4. Norme ISO 6579, Directives générales concernant les méthodes de recherche des Salmonella, AFNOR, Décembre 1993. 5.

　　5.F.D.A., Bacteriological Analytical Manual, 7th ed., 1992, publ. and dist. by AOAC International, Arlington, Virginia, 2201-3301, USA

　　AFNOR通过与NF EN ISO 6579（2002版）标准相比较，对VIDAS SLM（货号30702）更新了认证。

　　更新后的方法如下：

人与动物食品

　　1/前增菌：向225ml缓冲蛋白胨水中，用无菌方法加入25g(25ml)标本，或1份标本加入9份缓冲蛋白胨水。对于特定的食品，建议采用ISO 6887-1至6887-4的方法。在消化袋中均质化， 37+1℃孵育16-20小时。

　　注：奶粉

　　建议先在消化袋中加入缓冲蛋白胨水再将奶粉撒在表面，室温放置30分钟使其水化再进行孵育。

　　2/增菌：孵育后，取1ml前增菌悬液加入10ml含四硫磺酸盐和新生霉素的M肉汤（MKTTn肉汤）中，37+1℃孵育6-8小时

　　同时取0.1ml前增菌液加入10ml Rappaport Vassiliadis Soya肉汤(RVS肉汤)。41.5+1℃孵育6-8小时。

　　3/后增菌：孵育后，从MKTTn肉汤取0.1ml加入10ml M肉汤，再从RVS肉汤中取1ml加入另一管10ml M肉汤。再在各自的温度孵育MKTTn肉汤和RVS肉汤18小时。

　　将两管M肉汤在41.5+1℃孵育16-20小时。

　　孵育之后，从两份M肉汤中各取1ml肉汤加入同一个试管并封口，95-100℃水浴15+1分钟，冷却后进行VIDAS测定。

　　将剩余的M肉汤、MKTTn肉汤和RVS肉汤的标本保存于2-8℃以便对VIDAS沙门氏菌测定阳性结果确证。

　　注：**如果不能马上进行VIDAS检测，孵育的肉汤可在2-8℃保存24小时。

　　**如果VIDAS SLM测试结果为阳性，确证试验必须在MKTTn肉汤和RVS肉汤孵育完成后24小时内进行。

　　1/前增菌：向225ml缓冲蛋白胨水中，用无菌方法加入25g(25ml)标本，或1份标本加入9份缓冲蛋白胨水。对于特定的食品，建议采用ISO 6887-1至6887-4的方法。在消化袋中均质化， 37+1℃孵育16-20小时。

　　注：奶粉

　　建议先在消化袋中加入缓冲蛋白胨水再将奶粉撒在表面，室温放置30分钟使其水化再进行孵育。

　　2/增菌：孵育后，取0.1ml前增菌液加入10ml Rappaport Vassiliadis Soya肉汤(RVS肉汤)。41.5+1℃孵育6-8小时。

　　3/后增菌：孵育后，从RVS肉汤中取1ml加入10ml M肉汤。在41.5+1℃再孵育RVS肉汤18小时。

　　将M肉汤在41.5+1℃孵育16-20小时。

　　孵育之后，从M肉汤中取1ml肉汤加入一个试管并封口，95-100℃水浴15+1分钟，冷却后进行VIDAS测定。

　　将剩余的M肉汤和RVS肉汤的标本保存于2-8℃以便对VIDAS沙门氏菌测定阳性结果确证。

　　注：**如果不能马上进行VIDAS检测，孵育的肉汤（M肉汤）可在2-8℃保存24小时。

　　**如果VIDAS SLM测试结果为阳性，确证试验必须在RVS肉汤41.5+1℃孵育完成后24小时内进行。

　　将增菌后的MKTTn肉汤和RVS肉汤转种至XLD平板和另一选择性平板。37+1℃孵育24+3小时。

　　从每一个选择性平板挑取至少一个特征性菌落，划线接种至营养琼脂平板使其生长繁殖。

　　对菌落进行纯度检验。进一步进行标准的生化（API板条）和血清学鉴定。如果鉴定为阴性，再取4个特征性菌落重复以上步骤。